第三代测序技术，也被称为单分子测序技术，包括PacBio的SMRT技术和Oxford Nanopore Technologies的纳米孔测序技术。这些技术的主要优点是可以获取长读长序列，但错误率较高。
实验设计：
1. 样品准备：根据研究目的选择合适的样本，可以是DNA、RNA或蛋白质。对于DNA样品，需要进行提取、纯化和定量；对于RNA样品，还需要进行反转录成cDNA。
2. 文库构建：将样品打断成适当的片段长度，然后通过接头连接，使片段两端带有特定的测序引物结合位点。对于PacBio SMRT测序，通常使用PCR扩增文库；对于Oxford Nanopore测序，可以直接使用未扩增的文库。
3. 测序：将文库加载到测序仪器上，进行单分子测序。在测序过程中，每一条分子都会被独立地读取和记录。
数据分析流程：
1. 原始数据质控：检查原始数据的质量，包括测序深度、读长分布、碱基质量等。
2. 数据预处理：去除低质量的读段，对读段进行修剪、去接头、纠错等操作。
3. 序列拼接：将预处理后的读段进行比对和拼接，得到全长序列。对于PacBio SMRT测序，可以使用Hgap或者Canu软件进行拼接；对于Oxford Nanopore测序，可以使用Minimap2和Miniasm软件进行拼接。
4. 结果分析：对拼接结果进行评估和注释，例如计算基因组覆盖率、比较不同样品之间的差异等。
5. 后期应用：根据研究目的，将分析结果应用于各种生物学问题的研究，例如基因结构和功能分析、进化分析、疾病相关变异检测等。
