蛋白质表达水平检测实验是生物学研究中常用的一种方法，主要用于研究特定基因在不同条件下的表达情况。这个实验通常包括以下几个步骤： 1. 提取总蛋白：首先需要从待测样本中提取出总蛋白。常用的提取方法有超声破碎法、研磨法、裂解缓冲液提取法等。 2. 蛋白质定量：提取出的总蛋白需要进行定量，以便后续的Western Blotting或ELISA等实验。常用的定量方法有BCA法、Bradford法、Lowry法等。 3. 蛋白质电泳：将定量后的蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳，根据分子量大小分离蛋白质。 4. 转膜：将电泳后的蛋白质转移到PVDF或NC膜上。 5. 封闭和一抗孵育：用封闭液封闭膜上的非特异性结合位点，然后加入一抗（针对目标蛋白的抗体）进行孵育。 6. 二抗孵育：洗膜后，加入标记有HRP或荧光素的二抗（针对一抗的抗体）进行孵育。 7. 显色或成像：如果使用的是HRP标记的二抗，可以使用ECL化学发光试剂进行显色，然后用胶片曝光；如果使用的是荧光素标记的二抗，可以直接用荧光成像系统进行成像。 8. 数据分析：通过比较目的蛋白条带的灰度值与内参蛋白条带的灰度值，可以计算出目的蛋白的相对表达量。 以上就是蛋白质表达水平检测实验的基本流程。需要注意的是，不同的实验条件和目的可能需要对上述步骤进行适当的调整。 3.7.1 Western blotting Western blotting，又称为蛋白质免疫印迹，是一种在分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的技术。它主要用于检测特定蛋白质的存在与否，以及其相对量。 以下是进行Western blotting的基本步骤： 1. 蛋白质提取：首先，从细胞或组织中提取蛋白质。这通常通过裂解细胞或组织并使用离心来分离蛋白质和其他细胞成分来完成。 2. 蛋白质定量：使用一种称为Bradford或BCA的方法来测量蛋白质的浓度。 3. 蛋白质电泳：将蛋白质样品加到一种叫做聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的凝胶中，并施加电压使蛋白质根据其大小分离。 4. 转膜：一旦蛋白质在凝胶中分离，它们会被转移到一个叫做硝酸纤维素或PVDF的膜上。这个过程叫做转膜。 5. 封闭：为了防止非特异性结合，用封闭液（通常是脱脂奶粉或BSA溶液）处理膜。 6. 一抗孵育：然后，将膜与含有目标蛋白质抗体的一抗孵育。这些抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。 7. 洗涤：洗涤膜以去除未结合的一抗。 8. 二抗孵育：将膜与能与一抗结合的标记有酶或荧光染料的二抗孵育。 9. 洗涤：再次洗涤膜以去除未结合的二抗。 10. 显色：对于酶标记的二抗，可以添加底物来产生颜色反应，从而显示蛋白质的位置。对于荧光标记的二抗，可以直接在荧光成像系统下观察结果。 以上就是Western blotting的基本过程。通过这个过程，我们可以获得关于样本中特定蛋白质的信息，这对于研究蛋白质的功能和表达水平具有重要意义。