mRNA-seq（全称Messenger RNA sequencing）是一种用于测定细胞中基因表达水平的高通量测序技术。这项技术通过将mRNA转化为cDNA，然后进行测序，可以获取每个基因在特定样本中的表达量信息。 具体步骤如下： 1. mRNA分离：首先从细胞或组织样本中提取总RNA，然后通过 oligo(dT)纤维素或磁珠等方法富集mRNA。 2. cDNA合成：使用反转录酶将mRNA逆转录成cDNA。在这个过程中，为了提高效率和均一性，通常会加入带有随机接头的引物。 3. 文库构建：对cDNA进行打断，然后在两端加上测序接头，形成测序文库。这个过程可能还包括大小选择、PCR扩增等步骤。 4. 高通量测序：将构建好的文库加载到测序平台上，进行高通量测序。常用的测序平台有Illumina、Pacific Biosciences、Oxford Nanopore等。 5. 数据分析：通过对测序数据进行比对、定量、差异表达分析等步骤，可以得到每个基因在不同样本中的表达量信息。这些信息可以用来研究基因功能、调控网络、疾病机制等生物学问题。 mRNA-seq具有灵敏度高、动态范围广、无偏性等优点，已经成为研究基因表达的重要工具。同时，它也可以用于发现新的转录本、可变剪接事件、非编码RNA等功能元件。 1.2.2 small RNA-seq Small RNA-seq，即小RNA测序，是一种研究细胞内小RNA分子的技术。这些小RNA分子通常长度在18-30个核苷酸之间，包括microRNA、siRNA、piRNA等。它们在许多生物学过程中发挥着关键作用，如基因表达调控、转录后调控、染色质修饰和基因组稳定性维护等。 Small RNA-seq的基本步骤包括：首先，从细胞或组织中提取总RNA；然后，选择合适的方法富集小RNA分子，如使用寡核苷酸探针或者基于大小的分离方法；接着，将富集到的小RNA分子进行逆转录，生成cDNA；再通过PCR扩增得到足够的cDNA用于后续测序；最后，利用高通量测序技术（如Illumina、Ion Torrent等）对小RNA进行测序。 Small RNA-seq可以提供全面、精确的小RNA信息，包括小RNA的序列、丰度、表达谱以及潜在的功能。通过比较不同样本之间的差异，可以揭示各种生理病理状态下小RNA的变化规律，为疾病诊断、治疗和药物研发提供新的思路和策略。